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CCR7趋化因子受体刺激诱导树突状细胞(DC)向引流淋巴结快速而短暂的迁移,这对于启动保护性免疫和维持免疫稳态至关重要。然而,终止CCR7介导DC迁移的机制尚不完全清楚。近期,曹雪涛研究组和刘娟研究组在Immunity(IF21.522)期刊发表了题为CCR7 Chemokine Receptor-Inducible lnc-Dpf3 Restrains Dendritic Cell Migration by Inhibiting HIF-1a-Mediated Glycolysis的研究成果。报道了一种长链非编码RNA lnc-Dpf3通过抑制HIF-1α介导的糖酵解来反馈抑制CCR7介导的DC迁移。证明了CCR7诱导的lnc-Dpf3在耦合表观遗传和代谢途径,以反馈调控DC迁移和炎症反应方面的关键作用。进一步揭示了炎症免疫反应后期及时终止DC迁移并减弱其免疫激活功能的分子机制。

主要研究路线

◾  lncRNA表达谱分析鉴定参与DC迁移的lncRNA分子(研究结果1)

◾  构建lnc-Dpf3缺失小鼠模型进行体内外功能研究及表型鉴定(研究结果2-3)

◾  确定调控lnc-Dpf3表达的机制(研究结果4)

◾  确定lnc-Dpf3抑制DC迁移的分子机制(研究结果5-7)

主要研究结果

1、lnc-Dpf3抑制CCR7介导的DC迁移

之前的研究已将STAT3结合的lnc-DC鉴定为DC成熟的关键调节因子。然而,lncRNAs在DC迁移中的功能仍然未知。有研究表明,呼吸道DCs从肺部向引流淋巴结(dLNs)快速而瞬时的迁移早在肺部病毒感染后6h就发生了,并在感染后18h迅速减缓;皮肤刺激也可在24h内诱导类似的DC从皮肤向dLNs迁移的瞬时性增加。因此,研究人员猜想CCR7刺激可能会在DC向dLNs迁移的峰值(体内感染或刺激后约18-24h)后诱导细胞内变化,从而起到反馈作用,防止DC过度积累。

为了验证猜想,研究人员制备了LPS刺激的骨髓源性DCs(成熟DCs,mDCs),然后在体外用或不用CCR7配体CCL19和CCL21刺激mDCs 12小时。通过lncRNA表达谱分析,在CCR7刺激的mDCs中共检测到34个差异表达的lncRNAs(18个上调,26个下调)。对18个上调的lncRNAs进行qRT-PCR分析证实,其中6个在CCR7刺激后显著上调。随后,通过对这6个lncRNAs进行RNAi介导的功能筛选,发现CCR7介导的mDC在体外的迁移可以通过沉默一个内含子lncRNA而显著增加,该内含子lncRNA位于小鼠Dpf3基因的内含子1内,因此命名为lnc-Dpf3。

RACE实验确定了lnc-Dpf3序列有4076个核苷酸。并且像大多数lncRNAs一样,lnc-Dpf3有5’帽子结构和polyA尾,但没有蛋白编码能力。此外,证实了使用不同的silencers(该研究涉及的smart silencers由3条siRNA和3条ASO组成,可全方位高效抑制细胞核和细胞质定位的lncRNA或mRNA,均由锐博生物提供)沉默lnc-Dpf3可以有效地增加CCR7介导的mDC迁移。表明lnc-Dpf3在体外参与抑制DC迁移。

2、 DC特异性lnc-Dpf3缺失可选择性促进CCR7介导的DC迁移

为了进一步探索lnc-Dpf3的生物学作用,研究人员通过同源重组产生了CD11c+DCs中lnc-Dpf3特异性缺失的lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠。并且证实了DC特异性DCS-Dpf3缺失不影响主要免疫细胞亚群的分化,也不影响DC的成熟和T细胞刺激能力。

那么,lnc-Dpf3缺失是否会影响CCR7触发的DC迁移呢?研究人员发现与对照相比,CCR7刺激12h后,来自lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠的未成熟和成熟DCs的迁移增加。腺病毒介导的lnc-Dpf3过表达在12h后减少了CCR7触发的DC迁移。但是在CCR7刺激后的早期阶段lnc-Dpf3不影响DC的迁移。表明lnc-Dpf3在体外反馈抑制CCR7触发的后期DC迁移中具有选择性作用。

接下来,研究人员探索了lnc-Dpf3在体内的功能。发现与对照mDCs相比,lnc-Dpf3沉默的mDCs在注射后期(24-48h)显示出向dLNs的迁移增加。同样地,与注射后24-48h的mDCs相比,来自lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠的mDCs向dLNs的迁移也呈增加趋势。用FITC涂抹皮肤后48 h,lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠dLNs中FITC+ DCs的比例增加。表明lnc-Dpf3在体内抑制后期DC向dLNs的迁移。

3、 DC特异性lnc-Dpf3缺陷小鼠出现更严重的炎症

研究人员接下来探讨了lnc-Dpf3在体内控制DC依赖性炎症反应中的生理作用。以2,4-二硝基氟苯(DNFB)作为抗原的小鼠接触性过敏(CHS)是一种成熟的人类接触性皮炎模型,依赖于CCR7介导DC向dLNs的转运。研究人员发现lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠在CHS诱导后出现更严重的炎症反应,表现为耳肿胀程度加重、组织损伤加重、炎症浸润加重。这些小鼠的炎症被发现在扩大的Th1和Th17细胞群,并且与对照相比,DNBS体外再刺激后dLNs中干扰素(IFN)-g和白细胞介素(IL)-17的浓度更高。此外,注射lnc-dpf3(负载DNBS)沉默的mDCs的小鼠在接受DNFB刺激后比对照小鼠产生更强的CHS反应。因此,lnc-Dpf3可减弱DCs的适应性反应和炎症损伤。

由于稳定条件下CCR7介导的DC向dLNs的迁移有助于外周耐受,lnc-Dpf3是否也参与了稳态DC的迁移呢?研究发现lnc-Dpf3既不影响稳态DC迁移,也不影响外周耐受的产生。并且在稳态和炎性条件下,lnc-Dpf3在迁移DCs中均上调,但在炎症条件下,又可选择性减弱CCR7介导的DC迁移。

4、 CCR7刺激通过去除m6A修饰上调lnc-Dpf3的表达,以防止其降解

由于lnc-Dpf3的动态表达与其调控功能模式密切相关,那么lnc-Dpf3是如何被CCR7刺激调控的呢。研究人员首先通过ChIP实验确定了CCR7刺激在转录水平上对lnc-Dpf3基因表达无影响,因此排除转录机制。接下来,研究了CCR7刺激是否影响lnc-Dpf3的亚细胞定位。FISH实验发现lnc-Dpf3主要定位在胞质中,少部分位于细胞核。但CCR7刺激没有明显影响lnc-Dpf3的亚细胞分布。

随后,研究人员猜想CCR7刺激是否通过RNA稳定性的转录后调控增加了lnc-Dpf3的表达。由于m6A广泛影响RNA的代谢和稳定性,那么lnc-Dpf3在DCs中的动态表达是否受m6A相关调控呢?因此,研究人员通过MeRIP-qPCR在静息mDCs中检测到m6A显著富集在lnc-Dpf3第22片段(3766-3903 nt), 并且CCR7刺激显著降低了m6A的峰值。RIP实验表明,lnc-Dpf3的m6A峰被m6A reader Ythdf2识别,CCR7刺激可下调Ythdf2对lnc-Dpf3的识别。而Ythdf1或Ythdf2本身的表达不受CCR7刺激的影响。此外,用siRNA沉默Ythdf2可上调lnc-Dpf3的表达。

接下来,研究人员对位于lnc-Dpf3第22片段3812-3815nt和3852-3855nt处的两个m6A motifs进行突变并构建过表达质粒。发现与野生型相比,两个m6A motifs突变的lnc-Dpf3过表达质粒可导致lnc-Dpf3的生命周期延长。表明lnc-Dpf3这两个m6A修饰有助于lnc-Dpf3 RNA的衰变。MeRIP实验进一步证实了lnc-Dpf3在3812-3815 nt和3852-3855 nt处的m6A修饰在介导lnc-Dpf3 RNA降解中发挥协同作用。

表明lnc-Dpf3在3812-3815nt和3852-3855nt处具有m6A修饰,可被Ythdf2识别并靶向其降解。CCR7刺激通过介导m6A去甲基化和减轻lnc-Dpf3的m6A依赖性RNA降解来上调lnc-Dpf3表达。

5、CCR7-诱导型lnc-Dpf3通过靶向HIF-1a抑制DC迁移

研究人员通过一系列的排除实验发现通过PI3K、Akt和HIF-1α的信号传导可能参与CCR7介导的DC迁移的功能。HIF-1α是细胞对低氧应激反应的中心转录因子,在控制先天免疫反应和适应性免疫反应的各个方面发挥着重要作用。考虑到感染组织和淋巴结的低氧微环境,研究人员推测lnc-Dpf3可能通过调节HIF-1α的激活来调控CCR7介导的DC迁移。并且发现DC特异性HIF-1α缺陷小鼠在体内外都表现出DC迁移受损。因此,HIF-1α是CCR7介导的DC迁移所必需的。

值得注意的是,mDCs中lnc-Dpf3的沉默或缺失增加了CCR7刺激诱导的HIF-1α的核转位,而不影响细胞间总HIF-1α的丰度。RNA-seq分析证实,一系列HIF-1α靶向糖酵解基因(如Hk1,Ldha和Slc2a1)在lnc-Dpf3沉默的DCs中被上调。此外,EMSA和ChIP分析表明mDCs中lnc-Dpf3的沉默或缺失可增加mDCs中Ldha基因启动子区HIF-1α的DNA结合活性和积累。表明lnc-Dpf3能够减弱CCR7诱导的HIF-1α活性和糖酵解基因Ldha的表达。

然后,研究人员探索了lnc-Dpf3是否通过HIF-1α起作用。发现HIF-1α缺失可以阻断lnc-Dpf3沉默或过表达在增加或减少DC迁移中的作用,通过siRNA沉默Hif1α可以抵消lnc-Dpf3沉默或缺失在增加DC迁移中的作用。表明lnc-Dpf3通过靶向HIF-1α抑制CCR7介导的DC迁移。

6、 lnc-Dpf3通过抑制HIF-1α依赖性糖酵解来抑制DC迁移

为了弄清楚CCR7依赖性迁移的代谢基础,研究人员通过mDCs的代谢组学分析发现,在CCR7刺激后12小时,选择性CCR7可诱导与葡萄糖代谢相关的代谢中间体(如葡萄糖1-磷酸、葡萄糖6-磷酸和果糖6-磷酸)的积累。代谢途径富集分析(MPEA)表明,CCR7刺激可诱导与糖酵解密切相关的关键代谢途径的变化,如淀粉和蔗糖的代谢。此外,还发现CCR7刺激后DCs的胞外酸化(ECAR)快速且持续增加。并且作为代谢转向有氧糖酵解指标的ECAR/OCR(胞外酸化/耗氧量)比值在CCR7刺激12h后不断增加,在lnc-Dpf3沉默的DCs中比值更高。

随后,研究人员检测到mDCs中的葡萄糖摄取、乳酸产量,NAD+/NADH比值增加,表明lnc-Dpf3的沉默或缺失可增加CCR7诱导的糖酵解;相反,过表达lnc-Dpf3或DC特异性HIF-1α缺失会抑制CCR7刺激mDCs中的乳酸产生。重要的是,用糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-DG)处理DCs可以在体内外抑制CCR7介导的DC迁移,并消除lnc-Dpf3沉默或缺失在增加DC迁移中的作用。因此,lnc-Dpf3是通过抑制糖酵解负调控后期DC迁移。

以上数据表明CCR7刺激可诱导DCs中HIF-1α依赖性糖酵解反应,并且lnc-Dpf3通过抑制HIF-1α依赖性代谢重编程转向有氧糖酵解来抑制CCR7介导的DC迁移。

7、lnc-Dpf3通过HRE motif直接抑制HIF-1α从而抑制DC糖酵解

由于Hif1α自身mRNA表达不受lnc-Dpf3的影响,研究人员推测lnc-Dpf3可能与HIF-1α物理相关并通过翻译后机制调控其活性。随后通过RIP实验、FISH实验和邻位连接技术证实了lnc-Dpf3和HIF-1α之间的物理相互作用,并且CCR7刺激增加了这种相互作用。接下来,研究人员用缺氧反应元件(HRE)驱动的荧光素酶报告基因来检测HEK293T细胞中的HIF-1α活性,HEK293T细胞是一种具有与mDCs类似的CCR7蛋白表达的细胞系。发现在常氧和缺氧条件下,CCR7刺激均以Akt依赖性方式增强HIF-1α活性。过表达lnc-Dpf3抑制了HIF-1α的活化。随后RNA pull-down实验证实了全长lnc-Dpf3及其3000–4076 nt(F4)片段均可直接结合HIF-1α。

为了确定HIF-1α与lnc-Dpf3结合的区域,研究人员通过RIP实验证实HIF-1α的NT1(N-末端结构域1,1-200 aa)和CT(C末端结构域,600-826 aa)结构域可以结合lnc-Dpf3,其他结构域则不行。此外,lnc-Dpf3主要在细胞质中与HIF-1α和CT结构域结合,与HIF-1α的NT1结构域的结合主要发生在细胞核中。

众所周知,HIF-1α与靶基因启动子区称为缺氧反应元件(HREs)的核心核苷酸序列相结合。那么,HIF-1α是否可以与lncRNA上的HRE元件相互作用呢?研究人员发现在lnc-Dpf3 F4片段内的3686-3690nt处含有一个HRE motif,且该HRE-motif突变可部分削弱F4片段抑制HIF-1α活性的能力,并可消除lnc-Dpf3与HIF-1α的结合。腺病毒介导的lnc-Dpf3过表达,而不是其△HRE突变,可抑制CCR7介导的DC迁移和乳酸生成,并且可以挽救lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠mDCs中过度的DC迁移和乳酸生成。

接下来,研究人员构建了过表达WT HIF-1α慢病毒载体或在HIF-1α CT结构域中两个保守氨基酸发生丙氨酸突变的慢病毒载体,分别为D810A的组成型失活突变和N814A组成型激活突变。发现与HIF-1α-WT相比,HIF-1α-N814A过表达可增强DC迁移,而过表达HIF-1α-D810A则抑制DC迁移。此外,HIF-1α-D810A过表达后可消除lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+ DCs中迁移的增加。因此,HIF-1α活化对于lnc-Dpf3缺失引起的DC迁移增强至关重要。

总之,这些数据表明lnc-Dpf3通过其3000-4076nt结构域中的HRE motif与HIF-1α的N和C末端相互作用,并且该motif对于lnc-Dpf3抑制HIF-1α的活性和调节CCR7介导的DC迁移均具有重要作用。

原文:Liu J, Zhang X, Chen K, et al. CCR7 Chemokine Receptor-Inducible lnc-Dpf3 Restrains Dendritic Cell Migration by Inhibiting HIF-1α-Mediated Glycolysis[J]. Immunity, 2019, 50(3): 600-615. e15.

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