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锐博生物自主开发的riboEDIT™ CRISPR-Cas9体系是采用天然复合物系统(crRNA和tracrRNA)进行基因编辑。 锐博提供基于Cas9 mRNA的全RNA体系和基于Cas9蛋白的RNP体系,tracrRNA可实现大规模合成,靶向DNA目的序列的crRNA可以高通量合成,针对哺乳动物细胞可简单通过化学转染或电转方式进行基因编辑实验。该体系为即用型体系,不需要自行构建gRNA表达载体,无需在病毒级实验室中操作,无DNA组分,并且可实现多个crRNA指导下的多靶点编辑,大大简化前期实验准备与操作步骤。该体系更适合于高通量细胞水平的基因敲除筛选。锐博生物还提供业界领先的编辑效率保证CRISPR-Cas9套装产品,为基因编辑实验提供方便、省时、可靠和高效的解决方案。

产品优势

锐博专利情况:用于DNA编辑的系统及其应用,中国专利申请号:108977442A, PCT申请号:CN2018/088105

1.锐博专利技术:优化的crRNA,tracrRNA和Cas9 mRNA
2.瞬时表达,有效降低脱靶率
3.具有更高的编辑效率
4.毒性更低,激活先天免疫反应更小
5.即用型体系,更加易用,更适合从小规模实验到大规模高通量筛选
6.无需繁琐的克隆构建过程,节约更多人力和时间
7.无需病毒级实验室,大大降低基因编辑对实验环境的要求

riboEDIT™编辑效率保证套装、标准套装

锐博生物提供方便高效的基因编辑套装产品:效率保证套装标准套装效率保证套装针对人源基因,利用设计软件挑选评分高的5条crRNA进行合成,基于Cas9 mRNA的体系而配置必备试剂,包括tracrRNA、Cas9 mRNA、mRNA转染试剂、阳性对照crRNA套装、T7E1酶及配套缓冲液等,提供即用型的基因编辑套餐。其中效率保证套装可以实现MHCC97H细胞的T7E1酶切效率至少1条达到30%以上并提供相应的售后服务,标准套装不提供任何编辑效率的保证。

riboEDIT™ CRISPR-Cas9套装产品

产品名称 riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Set, 20T​
编辑效率保证套装* 套装编号:crG00001
标准套装 套装编号:crS00001

 *效率保证装:按说明书操作条件下,对MHCC97H细胞的T7E1酶切效率可实现至少1条达到30%以上,若5条均低于30%,客户须提供MHCC97H转染效率与检测方法步骤,经技术分析确认,免费重新优化设计,挑选合成5条crRNA并提供实验技术指导。标准套装不提供编辑效率有效性保证和免费重合服务,更多信息请见说明书。

套装名称 套装产品内容
riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Set
(基于mRNA的全RNA体系/针对人源细胞)
riboEDIT™ Designed crRNA(设计合成5条crRNA,每条5nmol)
riboEDIT™ tracrRNA, 5nmol
riboEDIT™ Positive Control crRNA Validation Set for Human *,  3*5nmol
riboFECT™ mRNA Transfection Reagent, 75ul
riboEDIT™ Cas9 mRNA (0.5ug/ul), 20ug
riboEDIT™ T7EI Enzyme (10U/ul), 100U

**Positive Control crRNA Validation Set for Human包括针对人源的阳性对照crRNA 5nmol、正向引物5nmol和反向引物5nmol

设计合成crRNA

riboEDIT™ Designed crRNA采用锐博生物优化的生物信息学设计,客户无需具备crRNA/sgRNA设计经验,crRNA包含20个与目标DNA序列互补配对的核苷酸(原间隔序列)和与tracrRNA互补配对的重复序列,涵盖人类和小鼠基因,每个基因设计合成3 – 6段单独的sgRNA,经过严格的PAGE纯化,其他物种crRNA设计需另行评估。

人源和小鼠设计合成crRNA的参考价格:5nmol一条crRNA是1250元。

crRNA阳性对照套装

riboEDIT™ crRNA阳性对照套装用于检测基因剪切体系的正确性,该套装包括阳性对照crRNA、正向引物和反向引物。

化学合成tracrRNA

riboEDIT™ tracrRNA采用化学合成tracrRNA,经PAGE纯化,能够抗核酸酶,能与crRNA结合形成crRNA/tracrRNA复合物,共同指导Cas9蛋白切割双链DNA。

Cas9 mRNA

riboEDIT™ Cas9 mRNA为体外转录生成,具有帽子和polyA尾巴结构,编码序列为人源密码子优化的S. pyogenes Cas9,带有核定位信号(NLS),C端的一个1XFLAG标签,5’非翻译区(5’UTR)及3’非翻译区(3’UTR),以促进mRNA的翻译和提高mRNA的稳定性,适用于哺乳动物细胞基因编辑。

应用举例:riboEDIT™ CRISPR-Cas9 mRNA与RNP体系高效基因编辑效率

riboEDIT™ Cas9 Expression mRNA具有高效的基因组剪切效率

图1. MHCC97H细胞共转染10pmol riboEDIT™ crRNA、10pmol riboEDIT™ tracrRNA和1ug riboEDIT™ Cas9 mRNA,48小时后 riboEDIT™ T7EI Enzyme酶切检测靶位点的剪切效率,候选7个靶基因的剪切条带及编辑效率。如图所示,#1#2表示同一基因不同位点设计的2条crRNA。

riboEDIT Cas9 RNP具有高效的基因组剪切效率

图2. MHCC97H细胞共转染6pmol riboEDIT™ crRNA、6pmol riboEDIT™ tracrRNA和6pmol riboEDIT™ Cas9 Protein,48小时后 riboEDIT™ T7EI Enzyme酶切检测靶位点的剪切效率,候选7个靶基因的剪切条带及编辑效率。如图所示,#1#2表示同一基因不同位点设计的2条crRNA。

图3.  riboEDIT™ CRISPR-Cas9 mRNA基因编辑体系与riboEDIT Cas9 RNP复合物具有等同的靶位点剪切活性。

常见问题解答

1. riboEDIT™ CRIPSR-Cas9体系相比于质粒载体表达Cas9和Cas9稳定表达细胞株或慢病毒系统有什么优势?

答:(1)riboEDIT™ CRIPSR-Cas9的全RNA体系或Cas9蛋白体系相比质粒载体或Cas9稳定表达细胞株而言,Cas9蛋白为瞬时表达,脱靶效率低、无DNA整合风险和启动子兼容性问题,大大提高应用安全性。
(2)即用型体系,通过一步转染,5-6个工作日即可完成编辑效率检测,操作简便,显著缩短实验周期。
(3)不需要自行构建载体或包装慢病毒,不需要病毒级的实验室环境。
(4)在大部分细胞中,比质粒表达载体具有更高的基因编辑效率。

2.如何快速确定crRNA的有效性?

crRNA/ tracrRNA 剪切效率与crRNA识别的靶序列有关,不同的crRNA剪切活性不同,推荐通过体外酶切实验,在体外酶切靶DNA片段,快速筛选有效的crRNA,获得高编辑效率的crRNA再进行后续的实验。

3. riboEDIT™ CRISPR-Cas9基因编辑系统识别的PAM序列是什么?

答: riboEDIT™ Cas9 mRNA和riboEDIT™ Cas9 Protein S. pyogenes Cas9为S. pyogenes Cas9,识别PAM序列NGG,N代表A,T,C,G。

4. riboEDIT™ Pre-designed crRNA如何保证低的脱靶效率?

答:从crRNA的设计角度,使用更严格的序列比对分析。

5. T7EI酶切检测编辑效率发现无剪切条带是什么原因?

答:可能原因如下:
(1) 细胞转染效率低,建议优化转染步骤或换用容易转染的细胞类型。
(2) Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解,可通过设置阳性对照组排除Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋
白降解的问题。
(3) 在细胞内,Cas9核酸酶无法接近靶位点或无法剪切靶位点,建议重新设计crRNA。
(4) 没有进行DNA片段的变性、退火步骤。可通过设置阳性对照组确认实验操作是否有误。

6. 琼脂糖凝胶电泳分析剪切效率时非特异性条带多,无法分析剪切效率怎么办?

答:可通过设置阴性对照组来区分目标剪切条带和非目标条带。必要时,需重新设计引物,或通过优化PCR条件,来降低非特异性扩增。建议采用巢式PCR,提高扩增片段的特异性。

7. T7E1 突变检测时,出现条带弥散的现象,应该如何解决?

答: 由于T7E1 本身具有弱的非特异切割DNA 链的能力,所以遇到这种情况,可以增加DNA 用量,降低酶的用量,减少酶切时间来降低非特异切割现象。

8.对于从事诸如干细胞、原代细胞或悬浮细胞,应该选择哪一种riboEDIT™ CRIPSR-Cas9体系?

答: 干细胞、原代细胞或悬浮细胞等难转染细胞,转染试剂一般很难达到理想的转染效果,电转方式更适合这类细胞的转染,根据目前文献支持,Cas9 RNP体系用于电转具有更高的基因编辑效率,对于上述难转染的细胞推荐用riboEDIT™ CRISPR/Cas9 RNP体系,具体实验条件需要自行优化。

9.是否可以将多条crRNA混合转染?

答:可以,不论是混合转染还是单条转染,每条crRNA都按照本说明书同样稀释使用。

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产品编号 产品名称 目录价数量操作
crG00001 riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Guarantee Set, 20T(基因编辑效率保证套装) ¥15,990.00 - 开始定制
crS00001 riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Standard Set, 20T(基因编辑标准套装) ¥11,990.00 - 开始定制
CR-NRA-1 riboEDIT Designed crRNA(设计合成crRNA) 询价 - 开始定制
crRP0001VS riboEDIT Positive Control crRNA Validation Set for Human (验证用阳性对照crRNA及正反引物) ¥1,000.00
crT00001-5 riboEDIT tracrRNA, 5nmol ¥628.00
crT00001-20 riboEDIT tracrRNA, 20nmol ¥1,380.00
C11055-1 riboEDIT mRNA Transfection Reagent, 75ul ¥800.00
C11057-1 riboEDIT Cas9 mRNA (0.5ug/ul), 20ug ¥2,950.00
C11053-1 riboEDIT Cas9 Protein, S.pyogenes(20uM), 500pmol ¥1,260.00
C11054-1 riboEDIT T7EI Enzyme (10U/ul),100U ¥880.00
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